一、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

1. 試劑與耗材
   • 檢查試劑盒組分：裂解液(Buffer AL/BL)、洗滌液(Buffer AW1/AW2)、洗脫液(Buffer AE)、蛋白酶K、吸附柱、收集管等。
   • 自備物品：無水乙醇(如需添加到洗滌液中)、離心機(jī)、移液器、1.5mL離心管、渦旋振蕩器、水浴鍋(或金屬浴)。
2. 樣本處理
   • 使用EDTA抗凝全血，確保樣本未溶血。若樣本量不足，可用生理鹽水或PBS稀釋至推薦體積(如200-500μL)。

二、詳細(xì)操作步驟

步驟1：紅細(xì)胞裂解(可選，視試劑盒設(shè)計而定)

• 目的：去除紅細(xì)胞，保留白細(xì)胞核。
• 操作：
  1. 將全血樣本轉(zhuǎn)移至15mL離心管，加入3-5倍體積的紅細(xì)胞裂解液(如Buffer EL)。
  2. 顛倒混勻后，室溫靜置5-10分鐘，期間輕彈管底以促進(jìn)裂解。
  3. 2000×g離心5分鐘，棄上清(含裂解的紅細(xì)胞)。
  4. 重復(fù)上述步驟直至沉淀呈白色(白細(xì)胞團(tuán)塊)。

步驟2：細(xì)胞裂解與DNA釋放

• 目的：裂解白細(xì)胞，釋放基因組DNA。
• 操作：
  1. 向白細(xì)胞沉淀中加入200μL Buffer AL(含蛋白酶K)，渦旋振蕩15秒。
  2. 56℃水浴孵育10-30分鐘(或根據(jù)試劑盒要求)，期間每隔5分鐘渦旋一次。
  3. 孵育后短暫離心，使管蓋液體回落。

步驟3：DNA結(jié)合至吸附柱

• 目的：將DNA吸附到硅膠膜上。
• 操作：
  1. 向裂解液中加入200μL無水乙醇，渦旋混勻(若試劑盒已預(yù)加乙醇，則跳過此步)。
  2. 將混合液轉(zhuǎn)移至吸附柱(置于2mL收集管中)，8000×g離心1分鐘。
  3. 棄收集管中廢液，將吸附柱放回原收集管。

步驟4：洗滌純化DNA

• 目的：去除蛋白質(zhì)、鹽分等雜質(zhì)。
• 操作：
  1. 向吸附柱中加入500μL Buffer AW1，8000×g離心1分鐘，棄廢液。
  2. 加入500μL Buffer AW2(含乙醇)，14000×g離心3分鐘，去除殘留乙醇。
  3. 重復(fù)離心一次(空管)，確保吸附柱干燥。

步驟5：DNA洗脫與收集

• 目的：將純化的DNA從吸附柱上洗脫。
• 操作：
  1. 將吸附柱轉(zhuǎn)移至新的1.5mL離心管，向膜中央加入100-200μL預(yù)熱至65℃的Buffer AE。
  2. 室溫靜置5分鐘，8000×g離心1分鐘。
  3. 可選擇重復(fù)洗脫一次以提高回收率(將洗脫液重新加入吸附柱，再次離心)。

三、關(guān)鍵注意事項(xiàng)

1. 溫度控制
   • 蛋白酶K裂解步驟需在56℃進(jìn)行，溫度過低會導(dǎo)致裂解不完全。
   • 洗脫液預(yù)熱至65℃可提高DNA洗脫效率。
2. 乙醇添加
   • 若洗滌液需自行添加乙醇，務(wù)必使用無水乙醇，并確保終濃度符合試劑盒要求。
3. 離心條件
   • 離心速度和時間需嚴(yán)格遵循說明書，避免DNA斷裂或吸附不完全。
4. 避免污染
   • 所有操作應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行，使用無DNA酶的耗材和移液器吸頭。

四、結(jié)果評估

• 濃度與純度：使用分光光度計測定DNA濃度(A260)和純度(A260/A280=1.8-2.0)。
• 完整性：通過瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA條帶(主帶應(yīng)集中于基因組DNA大小區(qū)域)。

五、常見問題與解決方案